این محیط ساخت شرکت Merck بوده و طریقه ساخت آن به قرار زیر می باشد:
۱۶ گرم از پودر مورد نظر را در ۱۰۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل کرده و در ۱۲۱ درجه سلسیوس به مدت ۲۰ دقیقه اتوکلاو شد . سپس در یخچال در دمای ۴ درجه سلسیوس نگهداری شد و در زمان انجام آزمایش قند ها (در اینجا دو قند لاکتوز و آرابینوز مورد بررسی قرار گرفت) در آب مقطر استریل حل شد و به صورت ۱ % به محیط اضافه گردید.
جدول(۳-۴) اجزای تشکیل دهنده محیط پایه قند

۳-۴-جمع آوری نمونه
در سال های ١٣٩٢و١٣٩٣ طی مدت ۶ ماه ،۳۵۰ نمونه بالینی مشکوک به انتروکوک از بیمارستان های میلاد،امام خمینی ،بقیه ا..(عج) از بخش های ICU، مراجعه کنندگان سرپایی،جمع آوری شده که این نمونه ها شامل : خون، ادرار، زخم، مایع مغزی-نخاعی، بال و ریه بوده اند.
۳-۵-جدا سازی سویه ها
در ابتدا برای تمایز انتروکوک ها از سایر استرپتوکوک ها ،نمونه مشکوک بر روی محیط بلاد آگار کشت داده و دیسک های باسیتراسین،اپتوچین وتری متوپریم/سولفامتوکسازول بر روی محیط کشت قرار داده شد.پس از ۲۴ ساعت انکوبایسون در دمای ٣۷ درجه سلسیوس ،در صورت عدم رشد باکتری در مجاورت این دیسک ها به انتروکوک بودن آنها مشکوک می شویم .

سپس کلنی های مشکوک به انتروکوک، بر روی محیط بایل اسکولین آگار کشت داده وبعداز ۲۴ ساعت انکوباسیون در دمای ٣۵ درجه سلسیوس ، تغییر رنگ محیط از زرد به قهوه ای تیره نشان دهنده هیدرولیز اسکولین است. گلوکز و اسکولتین (یک مولکول الکلی می باشد) آزاد می شود سپس اسکولتین با یون فریک موجود در محیط ایجاد کمپلکس سیاه رنگ می کند و رنگ محیط را به قهوه ای تیره تغییر می دهد . انتروکوک ها و غیر انتروکوک ها هر دو قادر به تجزیه ی اسکولین می باشند . سپس برای جدا نمودن آن دو از یکدیگر از رشد در محیط آبگوشت حاوی ۵/۶٪ کلرید سدیم استفاده شد . به این صورت که ۵/۶ درصد کلرید سدیم به محیط BHI براث افزوده و چند کلنی از نمونه مشکوک در آن تلقیح شد ،سپس به مدت ۷۲ ساعت در دمای ٣۵ درجه سلسیوس انکوبه شد . ایجاد کدورت نشان دهنده رشد باکتری است . انتروکوک ها قادر به رشد در این محیط می باشند در صورتی که غیر انتروکوک ها توانایی رشد در محیط حاوی۵/۶ ٪کلرید سدیم را ندارند.
پس از آن از نمونه های رشد کرده بر روی محیط بلادآگار گسترش تهیه گردید.به این صورت که یک قطره سرم فیزیولوژی روی لام گذاشته ،با لوپ از کلنی مورد نظر برداشته و گسترش تهیه شد. پس از خشک شدن گسترش بر روی لام، آن را با حرارت تثبیت کرده و رنگ آمیزی گرم انجام شد. به این ترتیب ،وجود کوکسی های گرم مثبت انتروکوک به طریقه میکروسکوپی تایید شد.
سپس برای اثبات وجود انتروکوک ها،از روی محیط بلادآگار آنها را در محیط مایع BHI تلقیح کرده و در انکوباتور شیکر دار در دمای ۴۲ درجه سلسیوس نگهداری شدند، پس از ۲۴ ساعت کدورت محیط از لحاظ رشد انتروکوک ها بررسی شد.
برای تایید ،سویه ها را در محیط BHI براث کشت داده و برای مدت ٣۰ دقیقه در دمای ۶۰ درجه سلسیوس در انکوباتور نگهداری شدند . سپس آنها را بر روی بلاد آگار کشت داده و به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور در دمای ٣۷ درجه سلسیوس نگهداری گردید. رشد باکتری ها در محیط بلاد آگار نشان دهنده زنده بودن آنها پس از تحمل دمای ۶۰درجه سلسیوس و انتروکوک بودن آنها است.
برای انجام تست کاتالاز،یک قطره آب اکسیژنه ٣٪ بر روی یک لام تمیز گذاشته شد.سپس یک کلنی از روی محیط بلاد آگار بر داشته شد و در آن حل کرده،پس از حل شدن کلنی ها در آب اکسیژنه به علت کاتالاز منفی بودن گونه های انتروکوک ،حباب های اکسیژن متصاعد نشد.
انجام تست قند لاکتوز جهت اثبات گونه های انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم انجام شد، به این صورت که پس از ساخت محیط پایه قند، پودر قند لاکتوز را در آب مقطر حل کرده و به اندازه ی ۱% به محیط پایه قند اضافه می شود .سپس باکتری ها در محیط تلقیح شده وبه مدت ٢۴ ساعت در دمای ٣۷ نشان دهنده مثبت بودن آزمایش است.
برای تشخیص گونه انتروکوکوس فکالیس از انتروکوکوس فاسیوم تست قند آرابینوز انجام شد پس از فیلتر کردن ۱% قند در محیط پایه قند ،سویه ها در محیط کشت داده شده و پس از انکوبه کردن به مدت ٢۴ ساعت در ٣۷ درجه سلسیوس تغییر رنگ محیط از قرمز به زرد اثبات گونه انتروکوکوس فاسیوم است.
۳-۶-نگهداری سویه ها
پس از شناسایی وجدا سازی باکتری ها،نمونه ها در محیط BHI براث کشت داده شد و به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور در دمای ٣۷ درجه سلسیوس نگهداری شد. پس از رشد باکتری ها و رسیدن به کدورت کافی، به میکروتیوپ های ۵/۱ میلی لیتری اپندورف انتقال داده شد و سپس ۵۰% گلیسرول استریل به آنها اضافه شد. سپس در ۲۰- درجه سلسیوس نگهداری شد. پس از مدت یک ماه به فریزر ۸۰- سلسیوس انتقال داده شدند.
۳-۷-آنتی بیوگرام
۳-۷-۱-تهیه سوسپانسیون باکتریایی
تعداد لازم از کلنی باکتری مورد نظر را در ۵ میلی لیتر سرم فیزیولوژی حل نموده تا جذب نوری (OD) معادل استاندارد نیم مک فارلند حاصل شود،سپس OD آن در طول موج nm۶٢۵ اندازه گیری شد. هر گاه میزان جذب معادل استاندارد نیم مک فارلند رسید از آن به عنوان سوسپانسیون باکتریایی استفاده گردید. بر اساس دستورالعمل استاندارد۲۱s-100Μ CLSI در تعیین حساسیت ضد میکروبی به روش تهیه رقت در محیط مایع میزان کدورت سوسپانسیون باکتری معادل استاندارد نیم مک فارلند می باشد که این میزان معادل ۱۰^۸×۵/۱ تعداد سلول باکتری در هر میلی متر مکعب می باشد . غلظت استاندارد نیم مک فارلند در اسپکتروفتومتر کالیبر شده دارای جذب نوری mc۱،در طول موج nm۶٢۵،جذب نوری بین ۰٨/۰تا ۱۳/۰ دارد.
۳-۷-۲-روش آنتی بیوگرام
جهت انجام آنتی بیوگرام یا تست حساسیت میکروبی از روش دیسک دیفیوژن (Bauer & Kirby) استفاده شد. نوع محیط کشت در اندازه هاله عدم رشد و میزان نفوذ آنتی بیوتیک تاثیر بسزایی دارد. محیط مولر هینتون آگار به عنوان محیط انتخابی برای این آزمایش به کار رفت . پس از اتوکلاو ،محیط مولر هینتون را در پلیت های ٨سانتی متری تقسیم کرده به طوری که قطر محیط ۴ میلی متر باشد و پس از بستن درب ،آنها را به مدت ۳۰-۱۰ در حرارت ۳۷ درجه سلسیوس قرار داده و سپس در کیسه های نایلونی کاملا در بسته در یخچال نگهداری شدند. این پلیت ها تا هفت روز پس از تهیه مصرف می شدند. دیسک های تتراسایکلین،جنتامایسین،اریترومایسین،کلرامفنیکل، سیپروفلوکسازین، ونکومایسین، تیکوپلانین و استرپتومایسین خریداری شده از شرکت MAST کشور آلمان تهیه شد. دیسک های ذخیره در حرارت ٢٠- درجه سلسیوس و دیسک های مصرفی در یخچال ،در۴- درجه سلسیوس نگهداری شدند.دیسک های مورد نظر را ۱تا ٢ ساعت قبل از انجام آزمایش از یخچال بیرون آورده تابه حرارت اتاق برسند و پس از مصرف بلافاصله به یخچال برگردانده شدند.
برای انجام آنتی بیوگرام، ابتدا جهت تهیه کشت تازه میکروبی ،نمونه ها بر روی محیط بلاد آگار کشت داده شده و ٢۴ساعت در ۳۷ درجه سلسیوس نگهداری شدند. سپس مقداری از کلنی باکتری ها را درسرم فیزیولوژی حل کرده و به مدت ۱ تا ۳ ساعت در داخل انکوباتور گذاشته شد تا کدورت آن برابر با کدورت نیم مک فارلند شود ،سپس به کمک سوآپ از سوسپانسیون میکروبی بر داشته و باکتری در تمام جهات روی محیط مولر هینتون آگار به صورت Method Streak کشت داده شد ،سپس به کمک پنس استریل ،دیسک های آنتی- بیوتیکی جنتامایسین، کلرامفنیکل، ونکومایسین، اریترومایسین، تتراسایکلین، سیپروفلوکسازین، استرپتومایسین در سطح پلیت قرار داده شده به مدت ١۶ تا ۱٨ ساعت در انکوباتور در ۳۷ درجه سلسیوس نگهداری شد. بعد با بهره گرفتن از یک خط کش دقیق، قطر هاله عدم رشد را بر حسب میلی متر اندازه گرفته و بر طبق استاندارد CLSI باکتری ها نسبت به آنتی بیوتیک به صورت حساس ،نیمه حساس و مقاوم گزارش شدند.
جدول(۳-۵) مشخصات دیسک های آنتی بیوتیکی استفاده شده