سویه ها به گونه ای انتخاب شدند که واکسن نهایی حاوی سلول های کشته شده فاز І باکتری سیاه سرفه و حداقل واجد فیمبریه ۲ و ۳ باشند. برخی آزمایشگاه های معتبر تحت نظارت سازمان جهانی بهداشت مرجع آماده سازی آنتی بادی ها برای تشخیص فیمبریه ۲ و ۳ می باشند. از آنجا که فعالیت همولیتیک باکتری به عنوان یک شاخص برای سلول های فاز І پیشنهاد می شود، کلنی های سیاه سرفه برای این ویژگی روی محیط جامد مناسب حاوی خون آزمایش می شوند. در حالیکه، برخی از سایر محیط های کشت نظیر پلیت عصاره گوشت فاز Ш و IV باکتری بوردتلاپرتوسیس را حمایت می کنند نه فاز І را از اینرو می تواند برای تائید فاز І باکتری سیاه سرفه مورد استفاده قرار گیرد. وقتی روش کشت برای ارزیابی فاز І استفاده می شود، لازم است که ترکیب کشت، نوع و غلظت خون و زمان انکوباسیون به درستی تعیین شود. سویه های واکسینال باید به گونه ای نگهداری شوند که باکتری توانایی حفظ ویژگی ها و پتانسیل های لازم را برای تبدیل به یک واکسن مناسب حفظ کند. فریز، خشک کردن (Freeze drying) و یا ذخیره سازی در نیتروژن مایع، روش های مناسب و رضایت بخش برای حفظ سویه های واکسینال است (۶۹).

۱-۶٫ اپیدمیولوژی
سیاه سرفه یک بیماری اندمیک با پیک‌های اپیدمیک ۵-۲ سال (به طور معمول ۴-۳ سال) است. گسترش واکسیناسیون سراسری سیاه‌سرفه در کودکان و متعاقباً کاهش شیوع بیماری به نظر نمی‌رسد که تغییری در وقوع اپیدمی‌ها داشته باشد که این امر خود مؤید گردش اندمیک باکتری در جمعیت جامعه است. هیچ الگوی فصلی ثابتی برای وقوع بیماری وجود ندارد. به نظر می‌رسد که تفاوتی در شیوع بیماری بنا به جنسیت وجود ندارد. به عنوان مثال در طول سال‌های ۲۰۰۳–۲۰۰۱ میلادی ۵۴% از موارد گزارش شده بیماری در آمریکا در دختران رخ داده است. با اینحال هنوز مشخص نیست که این تفاوت جنسی در وقوع بیماری، تفاوت در میزان عفونت، حدت و یا کمپلکس‌های بعد از عفونت باشد.
در برخی گزارش‌ها ابتلاء به بیماری در مرگ و میر ناشی از آن در دختران نسبت به پسران بالاتر است، اما شواهدی دال بر اینکه دختران حساسیت بیشتری نسبت به آقایان برای ابتلاء به بیماری داشته باشند وجود ندارد و مطالعات سرواپیدمیولوژیک در کشورهای مختلف هرگز بیانگر این مطلب نیست که آنتی‌بادی سیاه‌سرفه در دختران در مقایسه با پسران بیشتر است. قبل از تولید و رایج شدن واکسن سیاه‌سرفه انتظار می‌رفت که هر کودکی دیر یا زود باید دچار سیاه‌سرفه شود. بنابراین شاید اختلاف وقوع بیماری بین دختران و پسران ناشی از گزارش موارد بیشتری از بیماری برای دختران باشد. همچنین در مورد شیوع بیشتر بیماری در دختران بالغ و خانم‌های مسن شاید ناشی از تماس بیشتر آنها با کودکان مبتلاء به بیماری باشد (۴۸).
سیاه سرفه از طریق قطرات بزرگ تنفسی که توسط سرفه یا عطسه ایجاد می‌شود، منتقل می‌شود. انتقال غیرمستقیم از طریق قطرات کوچک معلق در هوا، اشیاء آلوده به باکتری و یا گرد و غبار به ندرت رخ می‌دهد.
اشخاص در فاز کاتارال و در اوایل فاز پاروکسیزمال قابلیت بالایی در انتقال عفونت دارند. سیاه‌سرفه به شدت واگیردار است، چراکه بیش از ۹۰% بیماری در تماس‌های معمول خانگی رخ می‌دهد. میزان انتقال بیماری در مدرسه ۸۰-۵۰% می‌باشد. سیاه‌سرفه در هر سنی ممکن است، اتفاق بیفتد. نوزادان در چند هفته اول زندگی نسبت به ابتلاء به بیماری سیاه‌سرفه بسیار حساس هستند، درست در این چند هفته اول نیز مرگ و میر ناشی از بیماری بالاترین میزان را دارا می‌باشد. برای سالیان متمادی اعتقاد بر این بود که یک بار ابتلاء به سیاه‌سرفه ایمنی مادام العمر علیه بیماری را ایجاد خواهد کرد.
بعد از گسترش واکسیناسیون تأثیر شیوع بیماری بر اساس سن در بین محققین مطرح شد. بدین ترتیب که تقریباً ۲۰% از کل بیماری سیاه‌سرفه در نوزادان کمتر از یک سال، قریب به ۶۰% از بیماری در کودکان بین سنین ۱ تا ۴ سال رخ می‌دهد. اطلاعات تایید نشده مربوط به زمان‌های قبل از آغاز واکسیناسیون بیانگر ابتلاء مجدد به بیماری در افراد می‌باشد. اما داده‌های اخیر ابتلای مجدد به بیماری را بسیار نادر می‌داند.
حالت ناقلین مزمن بیماری برای سیاه‌سرفه اثبات نشده، اما شواهدی درگذشته گزارش شده است که ناشی از عدم حساسیت بالای روش‌های کشت باکتری و شناسایی بیماری بوده است. استفاده گسترده از روش‌های شناسایی آنتی‌ژن برای تشخیص سیاه‌سرفه به ویژه روش بسیار حساس PCR این امکان را فراهم کرده است که بتوان بیماری سیاه‌سرفه را در هنگام شیوع حتی در صورت منفی بودن نمونه‌های کشت داده شده و عدم وجود علائم بیماری در اشخاص بیمار سریعاً تشخیص داد (۴۸).
۱-۶-۱٫ وضیعت بیماری در ایران
هر چند میزان موارد گزارش شده به سازمان جهانی بهداشت، طی سال های ۱۳۷۲ تا ۱۳۷۶ به ترتیب ۱۵، ۴۵، ۸۰ و ۵۰ مورد و سطح پوشش واکسیناسیون علیه این بیماری در کشورمان را ۱۰۰% ذکر کرده اند، ولی با توجه به اینکه بیشتر این بیماران به طور سرپایی تحت درمان قرار می گیرند و به نحو دقیقی ثبت و گزارش نمی گردد بدون شک، میزان موارد کشوری بمراتب بیش از این ارقام می باشد (۳).
۱-۷٫ بیماری‌زایی سیاه سرفه
دانش موجود در مورد اجزاء باکتری سیاه‌سرفه و اعمال آنها این امکان را فراهم آورده است که بتوان فرضیه ­های منطقی در مورد بیماری‌زائی این باکتری را در انسان ارائه نمود.
انتقال بیماری به واسطه ی باکتری‌های موجود در هوا از طریق بیمار واجد علائم بیماری به سلول‌های مژه‌دار اپیتلیوم‌ تنفسی میزبان حساس صورت می‌گیرد. باکتری سیاه‌سرفه بر ایمنی مخاطی دستگاه فوقانی تنفسی غلبه یافته و بیماری را در افراد سالم ایجاد می‌کند. باکتری از طریق ادهسین‌های مختلف به صورت قدرتمندی به سلول‌های مژه‌دار متصل می‌شود. اگرچه PT و FHA پروتئین‌های مهم اتصال باکتری به سلول هستند، اما پروتئین‌های فیمبریه، PRN و BrkA هم در این پروسه به خوبی شرکت دارند (۱۸).
باکتری به طور معمول به لایه‌های زیر اپیتلیوم دستگاه تنفس حمله نمی‌کند اما PT به جریان خون وارد می‌شود و اثرات بیولوژیکی‌اش را به طور سیستمیک در اندام‌های هدف ایجاد می‌ نماید.
PT، آدنیلات سیکلاز و BrkA برعملکرد ایمنی میزبان اثر قابل توجهی دارند.آدنیلات سیکلاز منجر به القاء تولید Cyclic AMP به میزان زیاد شده و سپس باعث تخریب فعالیت‌های مختلف سیستم ایمنی می‌شود. PT از کموتاکسی^[۶۳]سلول‌های فاگوسیت به محل جایگاه التهاب جلوگیری کرده و BrkA از باکتری در برابر مسیر کلاسیک کمپلمان حفاظت می‌کند. تراکئال سایتو توکسین و توکسین حساس به حرارت در تخریب اپیتلیوم تراکئوبرونشیال^[۶۴] دخالت می‌کنند. اگرچه مکانیسم‌های متوالی ذکر شده در بالا تظاهر تنفسی بیماری سیاه‌سرفه را شرح می‌دهد، مکانیسم انسفالوپاتی^[۶۵] که تظاهر بیماری بالینی را پیچیده می‌کند، نامشخص باقی مانده است (۴۵و۲۳).
مکانیسم های پاتوژنیک پیشنهاد شده برای بیماری سیاه‌سرفه شامل آنوکسی ثانویه^[۶۶] حاصل از پاروکسیزم^[۶۷]، اختلال متابولیکی، کاهش قند خون^[۶۸]، خونریزی جزئی داخل جمجمه‌ای^[۶۹] یا اثر توکسیک مستقیم بر روی مغز می‌باشد (۵۱).
۱-۸٫علائم کلینیکی
دوره کمون بیماری در نوزادان و کودکان معمولاً ۹ الی ۱۰ روز (متوسط ۶ الی ۲۰ روز) است. شروع بیماری مخفیانه است و نشانه های آن از سایر عفونت های خفیف دستگاه تنفسی فوقانی غیر قابل افتراق است. معمولاً تب، حداقل علامتی است که در کل دوره عفونت مشاهده می شود. سرفه ابتدا به صورت متناوب بوده و سپس در طول مدت ۱ تا ۲ هفته به سرفه های غیر قابل کنترل (پاروکسیزمال) تبدیل می گردد. پاروکسیزم در طول ۲ الی ۶ هفته تکرار و شدت آن افزایش می یابد. در این مرحله که با سرفه های شدید و پی در پی همراه است یک دم بلند با صدای خاص شنیده می شود و بازدم سریع بوده و گاهی به همراه آن استفراغ، سیانوز و تشنج رخ می دهد. سپس پاروکسیزم بتدریج فروکش می کند. در نبود ایمنی، بیشتر کودکان بیماری کاملاً پیشرفته ای را از خودشان نشان می دهند اما گزارش شده است که کودکان قبل از عفونت واجد نوعی ایمنی کلینیکی یا پاسخ آنتی بادی هستند که در صورت ابتلاء، بیماری خفیف آتپیک^[۷۰] را از خود نشان می­ دهند (۳۱).
در مرحله پاروکسیزمال سرفه ها بسیار شدید و حاد می شود در این مرحله است که بر اثر تشنج حاصل از سیاه سرفه، یک دم طولانی با صدای بلند خاص بنام هوپ^[۷۱]رخ می دهد. هوپ یک دم با صدا است که در اثر سختی عبور هوای دم از گلوتیس تنگ شده بعد از حدود ۱۲-۱۰ سرفه ناگهانی، شدید، کوتاه و بدون توقف ایجاد می شود. ویژگی هوپ غالباً در نوزادان کمتر دیده می شود.
پاروکسیزم یا همان حمله سرفه های ناگهانی و غیر قابل کنترل ممکن است ناشی از سختی خارج کردن موکوس ضخیم و غلیظ شده از مخاط ترانکوبرونشیال باشد یا اینکه از اثرات توکسین سیاه سرفه یا هر دوی آنها باشد. علائم بالینی در نوزادان در حمله ناگهانی سرفه، پریشانی و درد است و پس از آن بچه احساس خستگی می کند. متأسفانه در مدت زمان کوتاهی چندین پاروکسیزوم می ­تواند رخ دهد. بین پاروکسیزوم­ها، کودک ممکن است سرزنده و ظاهری کاملاً نرمال داشته باشد. پاروکسیزم ممکن است توسط غذا خوردن، خندیدن، گریه کردن و عوامل تحریک کننده دیگر رخ دهد و معمولاً شب ها بدتر است. در یک کودک مشکوک به سیاه سرفه، ضروری است که پزشک شاهد علائم کلینیکی پاروکسیزم باشد تا در صورت حصول اطمینان از عدم وجود ایست تنفسی^[۷۲] بتواند کودک را مانند یک بیمار سر پایی مدیریت نماید.
بهبودی از بیماری تدریجی خواهد بود. فرکانس رخداد پاروکسیزم بتدریج کمتر و ملایم تر شده و علامت هوپ یا دم صدادار از بین می رود. سرفه های غیر پاروکسیزمی ممکن است بمدت چند هفته در طول دوران نقاهت ^[۷۳]مقاومت کنند و در صورت همراه شدن بیماری با عفونت های تنفسی ویروسی رایج، سرفه های پاروکسیزمال بصورت انفجاری عود کند (۱۸).
۱-۹٫ تشخیص بیماری
شناسایی و مدیریت بالینی بیماری سیاه سرفه نیازمند ترکیبی از گمانه زنی های بالینی، تست های مناسب آزمایشگاهی و درمان مناسب آنتی بیوتیکی است (۱۶و۴۸).
۱-۹-۱٫ تشخیص بالینی
تشخیص بالینی بیمارمشکوک به سیاه سرفه ممکن است توسط علائم بالینی و نشانه ها و یا داشتن سابقه ای از قرار گرفتن در معرض یک مورد تأیید شده باشد (۴۸). .
تشخیص بالینی به دلیل طیف گسترده ای از تظاهرات بیماری چه در اطفال با سابقه واکسیناسیون و چه در اطفال بدون سابقه ایمنی مشکل ساز است. حساسیت و ویژگی تست های آزمایشگاهی تحت تأثیر عوامل مختلفی از قبیل استفاده بیمار از آنتی بیوتیک در مراحل اولیه ایجاد بیماری، عفونت های کمپلکس، سطح ایمنی بیمار، زمان بروز علایم پس از عفونت و همچنین عدم حساسیت ذاتی برخی تست ها قرار می گیرد (۱۱و۶۷).
۱-۹-۲٫ علائم کلینیکی در نوزادان
نوزادان با احتمال بیشتری سیاه سرفه کلاسیک را با دوره کمون ۱۰-۷ روز (بطور میانگین ۲۱-۵ روز) و متعاقب آن سه فاز از بیماری را به شرح ذیل تجربه می‌کنند:
* فاز کاتارال^[۷۴]: این فاز حدود یک یا دو هفته به طول می‌ انجامد و از علائم آن کوریزای پرودرمال غیراختصاصی^[۷۵]، سرفه خفیف می‌باشد.
* فاز پاروکسیزمال: این فاز حدود ۶-۴ هفته طول می‌کشد و از علائم آن سرفه اسپاسمی^[۷۶]، استفراغ بعد از سرفه و بازدم عمیق بعد از سرفه‌های طولانی می‌باشد.
* فاز نقاهت: علائم به آرامی در طول ۲-۱ هفته بهبود می‌یابد (۴۸).
عوارض در شیرخواران غیر ایمن شایع‌تر است. این عوارض شامل ذات الریه^[۷۷]، نارسایی رشد مرتبط با استفراغ بعد از سرفه، تشنج^[۷۸]، انسفالوپاتی^[۷۹]، هیپوکسی مغزی، عفونت باکتریایی ثانویه، افزایش فشار خون ریوی، خونریزی ملتحمه^[۸۰] و پرولاپس رکتوم^[۸۱] می‌باشد. علائم در نوزادان کم سن وسال ممکن است در ابتدا فقط تنگی نفس باشد. اکثر مرگ و میر ناشی از سیاه‌سرفه در کودکان کمتر از ۶ ماه، به خصوص در سنین زیر یک ماه اتفاق می‌افتد (۴۸ و ۱۷).
۱-۹-۳٫کودکان، نوجوانان و بزرگسالان
عفونت سیاه‌سرفه در کودکان، نوجوانان و بزرگسالان می تواند از “سیاه‌سرفه کلاسیک” با سرفه خفیف یا بدون سرفه شروع شود. در مطالعه‌ای که در سال ۲۰۰۸ در بریتانیا انجام شد، ۳۷ درصد از کودکان مراجعه کننده به طور متوالی با سن ۱۶-۵ سال، با سرفه بیش از ۱۴ روز پاسخ سرولوژیکی نسبت به سیاه‌سرفه داشتند. در حالیکه هیچ‌گونه تست کشت و یا PCR برای آنها انجام نشده بود. در کودکان با پاسخ مثبت سرولوژیک به بیماری سیاه‌سرفه، هوپ شایع‌تر از خس‌خس بوده است در حالیکه در کودکان سرو نگاتیو^[۸۲]در ۲۵% موارد هوپ و در ۷۵% دیگر سرفه‌های پاروکسیزمال شایع‌تر بوده است (۲۸).
در کودکان سرو پازتیو^[۸۳] حدت سرفه بیشتر بوده در ۸۵% از این جمعیت حتی تا ۲ ماه بعد از بروز بیماری نیز سرفه دوام داشته است. باید توجه داشت که کودکان تحت این مطالعه آخرین واکسن سیاه‌سرفه خویش را در سن ۴ ماهگی دریافت کرده بودند، ولی هم اکنون در انگلستان یک دوز بوستر از واکسن را در سن ۴ سالگی نیز تجویز می‌کنند. بیشتر موارد بیماری سیاه‌سرفه در بالغین در افرادی رخ می‌دهد که واجد سابقه واکسیناسیون و یا عفونت به سیاه‌سرفه بوده‌اند. بیماری سیاه‌سرفه به نظر می‌رسد که مسئول ۲۰-۱۳% از بالغین مبتلاء به سرفه‌های بلند مدت باشد. طول مدت سرفه در بزرگسالان مبتلاء به سیاه‌سرفه حدود ۴۸-۳۶ روز بوده و این سرفه صرفاً در شب‌ها^[۸۴] رخ می‌دهد. بروز اصلی بیماری سیاه‌سرفه معمولاً در بالغین و سالمندان با تأخیر بوده و پس از ۴ هفته سرفه و یا حتی زمان بیشتری رخ می‌دهد. تشخیص بیماری توسط پزشکان غالباً با تأخیر همراه است. عوارض در بزرگسالان ممکن است عوارضی حاد شامل بستری شدن، فتق ناف^[۸۵]، شکستگی دنده (کمتر از ۴%)، قطع شریان کاروتید^[۸۶]، خونریزی داخل جمجمه، ذات الریه (کمتر از۵٪)، سنکوپ^[۸۷]و سرفه (کمتر از ۶٪) باشد. مرگ بویژه در سالمندان با سن بالا ممکن است رخ دهد (۴۸)
جدول ۱-۲٫ علائم کلینیکی بیماری سیاه سرفه