۵- µl 100 از شیره استخراج شده را برای انجام آزمون استفاده می‌کنیم.

۱-زرده وسفیده تخم مرغ را در یک تویوپ تمیز می ریزیم به هم می زنیم تا یک ماده یکنواخت به دست اید
۲-۱میلیتر از نمونه را با ۳ میلیتر آب مقطر مخلوط کرده و در یک تیوپ پلاستیکی مقاوم به حرارت به قطر ۱/۵ cm میریزیم و حرارت می دهیم
۳-نمونه ها را به مدت ۱۲ دقیقه در دمای ۱۰۰ در حمام اب گرم قرار می دهیم
۴-به مدت ۳۰-۲۰ ثانیه آن را مخلوط می کنیم تا از لخته شدن آن جلوگیری کنیم و سپس آن را در دمای اتاق می گذاریم تا سرد شود
۵-۱۰۰میکرولیتر از مخلوط را برای آزمون استفاده می کنیم.
برای آماده سازی نمونه های شیر به روش تخم مرغ عمل می کنیم.
نحوه انجام آزمون:
۱- با یک قیچی تعداد تویوپی که برای آزمون نیاز هست را بریده و استفاده می‌کنیم. مواظب باشید که فویل یا سرپوش تویوپ‌های باقی مانده برداشته نشود تا از خشک شدن آن‌ ها جلوگیری شود و به سرعت آن را به دمای ۱۶-۴ درجه سانتیگراد برگردانید.
۲- تویوپ‌ها را برای حفاظت بیشتر در یک جعبه به صورت ایستاده نگهداری کنید سرپوش‌های تویوپ را برداشته و ml 100 از نمونه آماده شده را توسط پیتی که در کیت وجود دارد به تویوپ‌ها اضافه کنید. می توان یک نمونه کنترل منفی یا یک نمونه کنترل مثبت که با اسقفاده از استانداردهای آنتی‌بیوتیک مورد نظر آلوده شده در یک تویوپ دیگر در کنار تویوپ حاوی نمونه داشته باشیم.
۳- تویوپ‌ها را برای ۲۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
۴- تویوپ‌ها را برگردانده و محتویات آن را خارج کنید. تویوپ‌ها را با آب مقطر چند بار پر و خالی کنید تا شسته شوند. تمام آب مورد شستشو را با برگرداندن تویوپ بر روی یک دستمال یا حوله کاملاً خارج کنید تا قطره‌ای آب در تویوپ باقی نماند. برای ۴ بار عمل شستشو را انجام دهید.
۵- تویوپ‌ها را با یک سرپوش چسبنده پوشانده و آن را در دمای ۶۵ درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
۶- هنگامی که نمونه کنترل منفی به رنگ زرد درآمد باید انکوباسیون متوقف شود. که حدوداً مدت زمان برای دیدن این نشانه ۳-۲ ساعت است.
۷- تویوپ‌ها را از کنار نگاه کنید و نتیجه را بخوانید و هر نمونه را با نمونه کنترل منفی مقایسه کنید.
رنگ بنفش مایل به قهوه‌ای نشانه مثبت بودن و رنگ زرد نشانه منفی بودن آزمون است. هر رنگی به غیر از رنگ نمونه کنترل منفی نشانه این است که نمونه‌ها حاوی آنتی‌بیوتیک هستند. اگر جواب‌های بدست آمده مشکوک باشد باید آزمون دوباره انجام شود.

روش کوروماتوگرافی مایع

کروماتوگرافی مایع در اواخر دهه ۱۹۶۰ و اوایل دهه ۱۹۷۰ کشف شد. امروزه به طور گسترده از آن برای خالص سازی و استخراج مواد استفاده می‌کنند. در صنایعی همچون داروسازی، بیوتکنولوژی، پلیمر و صنایع مواد غذایی از آن استفاده می‌شود. بیشتر از یک دهه است که کوروماتوگرافی مایع به عنوان یک روش مؤثر برای انواع مواد به کار گرفته شده است.
در روش کوروماتوگرافی مایع نیاز به مواد فرار نیست. در نتیجه این یک مزیت نسبت به روش GC به حساب می‌آید. کوروماتوگرافی مایع براساس تزریقی کوچک از نمونه مایع در یک بخار مایع به نام فاز متحرک استوار است. که در یک ستون با ذره‌هایی ثابت محصور شده است.
جداسازی مخلوط مورد نظر و اجزای تشکیل دهنده آن به درجه تحمل و نگهداری هر جزء در ستون بستگی دارد. اندازه هر جزء در ستون به وسیله جزء‌بندی بین فاز مایع متحرک و فاز ساکن تعیین می‌گردد. در کوروماتوگرافی مایع این جزء‌بندی بر اثر تقابل مواد حل نشده موجود در فاز ساکن و مواد حل نشده در فاز مایع است. بنابراین برعکس روش GC هر تغییر در فاز مایع باعث یک تغییر بزرگ بر روی جداسازی مواد می‌شود. وقتی مواد تحرک مختلف داشته باشند در زمان‌های مختلفی در ستون دیده می‌شوند.
جدا کننده‌های مختلفی وجود دارند که می‌توان در فاز مایع از آن استفاده کرد. این دستگاه مواد موجود در فاز مایع را شناسایی می‌کند و آن را به سیگنال‌های الکتریکی برمی‌گرداند. قابل ذکر است هرگونه تغییر در شرایط اپراتور باعث می‌شود که بر روی زمان نگهداری و ابقا تاثیر گذار باشد و باعث مخدوش شدن جواب نهایی گردد. زمان ابقا زمانی است که بین تزریق و جداسازی تعریف شده است. در ادامه اجزاء دستگاه HPLC را توضیح می‌دهیم.

فاز متحرک

انتخاب صحیح ترکیب درصد و نوع فاز متحرک در انجام مؤثر آزمایش‌ها بسیار مهم می‌باشد، زیرا فاز متحرک متغیری است که برای جداسازی موفق نقش مهمی برعهده دارد. اما دامنه انتخاب ما به دلیل ستون و فاز ساکنی که انتخاب می‌کنیم محدود است و تمایز (مشخصه) اصلی بین کروماتوگرافی فاز معکوس و فاز نرمال می‌باشد. در سیستم فاز نرمال، حلال‌های غیرقطبی مانند هگزان یا ایزواکتان به کار می‌رود. در حالیکه در فاز معکوس از حلال‌های قطبی مانند انتخاب فاز متحرک مناسب با توجه به خواص فیزیکی حلال انجام می‌گیرد. فاکتورهایی که در این گزینش می‌تواند به ما کمک کند عبارتند از: قطبیت، قابلیت حل شدگی با حلال‌های دیگر، بی اثر بودن از لحاظ شیمیایی، طول موج نقطه قطع فرابنفش و سمیت. ضریب قطبیت معیاری از قابلیت یک حلال برای شستن یک جزء از درون ستون است.
در جدول ۳-۱ خلاصه‌ای از حلال‌های رایج که به عنوان فاز متحرک مورد استفاده قرار می‌گیرند ارائه شده و همچنین به بعضی از پارامترها که نقش مهمی در انتخاب فاز متحرک مناسب دارند اشاره شده است.
جدول ‏۳‑۱: حلال‌های متداول برای فاز متحرک در HPLC