نتایج مطالعه‌‌ای اسمل کرویک و همکاران (۲۰۰۶) مشخص کرد که اختلاف معنی داری در بعضی ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گونه‌های مختلف گل راعی نظیرHypericum maculatum, Hypericum olympicum, Hypericum perforatum جمع­آوری شده در سال­های متفاوت از بعضی مناطق با تنوع فصلی وجود دارد. همچنین گزارش شد که صفات ژنتیکی و عوامل اکولوژیکی از مهمترین عوامل مؤثر در نوع و میزان ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گل گونه‌های گل راعی هستند.

۳- مواد و روش‌ها
۳-۱- مواد گیاهی
در این تحقیق از گزنه‌های خودرو در ارتفاعات مختلف استان‌های مازندران و گلستان استفاده شد.
۳-۲- وسایل و دستگاه­های مورد استفاده

• • کلروفیل­سنج: جهت اندازه ­گیری میزان کلروفیل برگ­

• • خط­کش

• • ترازوی دیجیتال

• • آسیاب برقی

• • دستگاه موقعیت سنج (GPS)

• • سانتریفوژ آزمایشگاهی

• • دستگاه اسپکتروفتومتر

• • دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

۳-۳- مواد شیمیایی
مواد شیمیایی مورد استفاده در این تحقیق عبارت بودند از: متانول، معرف فولین سیوکالته^[۸]، کربنات سدیم، کلرید آلومینیوم، استات پتاسیم، تیوسولفات سدیم، استاندارد اسید گالیک، کوئرستین، کلروژنیک اسید، کافئیک اسید، روتین، استونیتریل، اسید استیک و اسیتو نیتریل.
تمامی مواد شیمیایی و معرف­ها از شرکت مرک و حلال­ها با بالاترین خلوص تهیه شدند.
۳-۴- آماده ­سازی گیاه گزنه
اجرای این پژوهش شامل دو مرحله می‌‌باشد. مرحله اول: شناسایی مکان رویش و جمع­آوری گیاه گزنه، پس از انتخاب مناطق در زمستان سال ۱۳۹۰ در زمان گلدهی گیاه گزنه (بهار سال ۹۱) جهت جمع­آوری به زیستگاه‌‌های مورد نظر در استان مازندران و گلستان مراجعه شد. سپس تعداد چندین نمونه کامل گیاهی به طور تصادفی از هر منطقه جمع­آوری و پس از بررسی برخی صفات مورفولوژیکی، اقدام به خشکاندن اندام‌‌های گیاه (برگ، ساقه، گل و ریشه) بصورت جداگانه در شرایط خشک، سایه و تهویه مناسب شد (شکل ۳-۱). اندام‌‌های خشک شده بصورت جداگانه با بهره گرفتن از آسیاب برقی به پودر تبدیل شده و از الک با مش ۱۸ عبور داده شد. نمونه‌‌های خشک شده در پاکت‌‌های مخصوص و نایلونی به منظور جلوگیری از نفوذ رطوبت در داخل آن بسته‌بندی شدند. و تا زمان آزمایش در فریزر ۱۸- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

شکل ۳-۱- الف- رویشگاه گزنه در منطقه چهارباغ گرگان، ب- فیروزجاه بابل، پ- خشک کردن گزنه
در زمان مراجعه به زیستگاه گزنه، از هر منطقه که گیاه مورد نظر جمع­آوری شد با بهره گرفتن از دستگاه موقیعت­سنج GPS اقدام به تعیین موقعیت جغرافیایی منطقه از نظر ارتفاع از سطح دریا، طول و عرض جغرافیایی گردید. برای بررسی خصوصیات اقلیمی زیستگاه‌‌ها بر اساس نزدیکترین ایستگاه هواشناسی به زیستگاه، آمار بلندمدت از پارامتر‌‌های هواشناسی مانند متوسط درجه‌‌حرارت و متوسط بارندگی تهیه شد (جدول ۳-۱). جهت تعیین مهمترین خصوصیات خاکشناسی از هر زیستگاه نمونه خاک تصادفی از عمق صفر تا ۳۰ سانتی‌متر برداشته شده و به آزمایشگاه خاکشناسی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان برای آزمون خاک انتقال داده شد. بافت خاک، ماده آلی خاک، شوری و اسیدیته خاک از مهمترین خصوصیات خاکشناسی مورد مطالعه بود (جدول ۳-۲). مرحله دوم: عصاره‌‌گیری و آنالیز بیوشیمیایی، جهت عصاره‌‌گیری و استخراج ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی از حلال متانول استفاده شد و برای آنالیز بیوشیمیایی ترکیبات فنلی(اسیدکلروژنیک و اسید کافئیک) و فلاونوئیدی (روتین) از روش کروماتوگرافی مایع (HPLC) استفاده شد.

۳-۵- صفات مورفولوژیکی مورد مطالعه گیاه گزنه
به منظور ارزیابی برخی صفات ریخت‌شناسی از هر منطقه پنج نمونه کامل گیاهی در فصل گلدهی گیاه انتخاب و ۱۳ صفت کمی رویشی و زایشی(طول برگ، عرض برگ، نسبت طول به عرض برگ، تعداد برگ در بوته، تعداد گره، فاصله گره، اندازه گل­آذین، تعداد گل­آذین در بوته، قطر ساقه، قطر ریشه، طول ریشه، ارتفاع گیاه و میزان کلروفیل) با پنج تکرار برای هر صفت بررسی شد.
۳-۶- صفات بیوشیمیایی مورد مطالعه گیاه گزنه
فنل و فلاونوئید کل، اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین.
جدول ۳-۱- مشخصات جغرافیایی و هواشناسی رویشگاه­های مورد مطالعه گیاه گزنه

جدول ۳-۲- مشخصات خاک رویشگاه­های مورد مطالعه گیاه گزنه

۳-۷- استخراج عصاره متانولی
به منظور تهیه عصاره متانولی، ابتدا نمونه‌‌ها (برگ، ریشه، ساقه و گل) بصورت جداگانه در دمای طبیعی (دمای اتاق) خشک شد، سپس با آسیاب برقی به خوبی پودر و از الک شماره ۱۸ گذرانده شد. نمونه‌‌های الک شده توزین شده و مقدار یک‌‌ گرم از هر نمونه به ارلن۱۰۰ میلی‌‌لیتری انتقال یافته و با ۱۰ سی‌‌سی متانول ۸۰ درصد (نسبت ۱ به ۱۰) مخلوط شد. سپس نمونه­ها به مدت ۲۴ ساعت روی همزن قرار داده شد، بعد به مدت ۵ دقیقه در ۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس عصاره خالص رویی برای اندازه‌‌گیری فنل کل و محتوی فلاونوئید نمونه‌ها مورد استفاده قرار گرفت.
۳-۷-۱- اندازه‌گیری فنل کل
مقدار کل ترکیبات فنلی موجود در عصاره گیاه گزنه توسط رنگ سنجی به روش فولین سیو کالتو (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، ۲۰۰۸) با کمی تغییر مورد بررسی قرار گرفت. در این روش مقدار کل ترکیبات فنلی بر اساس یک ترکیب فنلی که اغلب مواقع اسید گالیک می­باشد انتخاب و نتایج آن به صورت اکی­والانت اسید گالیک بیان می­گردد. ابتدا ۲۰ میکرولیتر از عصاره متانولی برداشته شده و با ۱۶/۱ میلی‌‌لیتر آب مقطر و ۱۰۰ میکرولیتر فولین سیوکالتیو مخلوط شد. بعد از ۸-۱ دقیقه استراحت، ۳۰۰ میکرولیتر کربنات‌‌سدیم یک مولار (۶/۱۰ گرم در ۱۰۰ میلی‌‌لیتر آب مقطر) به محلول افزوده شده و به مدت ۳۰ دقیقه در حمام بخار ^oC40 در تاریکی قرار گرفت. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. سپس محلول حاصل در طول موج ۷۶۰ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید. برای رسم منحنی کالیبراسیون از غلظت‌‌های متفاوت گالیک­اسید (۵۰، ۱۰۰، ۲۰۰، ۲۵۰، ۳۵۰ میلی‌‌گرم بر لیتر) در متانول: آب (۵۰:۵۰) استفاده گردید. در معادله خطی حاصل به‌‌جای Y، عدد قرائت شده در مقابل بلانک قرار داده شد و به این ترتیب X به‌‌دست آمد. این مقدار برای یک گرم در لیتر محاسبه شد و فنل کل بر حسب میلی‌‌گرم گالیک اسید در یک گرم نمونه خشک بدست آمد (شکل ۳-۲).

شکل ۳-۲- نمودار استاندارد گالیک اسید
۳-۷-۲- اندازه‌‌گیری محتوی فلاونوئیدی
برای محاسبه محتوای فلاونوئید از روش آلومینیوم کلراید (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، ۲۰۰۸) استفاده شد؛ به این صورت که ۵/۰ میلی‌‌لیتر از عصاره متانولی با ۵/۱ میلی‌‌لیتر متانول، ۱/۰ میلی‌‌لیتر آلومینیوم کلرید ۱۰درصد در اتانول (۱۰ گرم آلومینیوم کلرید در ۱۰۰ میلی‌‌لیتر اتانول و آب­مقطر)، ۱/۰ میلی‌‌لیتر استات­پتاسیم یک­مولار (۴۱/۲ گرم در ۱۰ میلی‌‌لیتر آب مقطر) و ۸/۲ میلی‌‌لیتر آب­مقطر مخلوط شد. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. محلول حاصل ۳۰ دقیقه در تاریکی قرار داده شده و سپس در طول موج ۴۱۵ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. جهت رسم منحنی استاندارد از غلظت‌‌های مختلف استاندارد کوئرستین (۱۰، ۵۰، ۱۰۰ و ۲۰۰ میلی‌‌گرم بر لیتر) استفاده شد. از معادله خط بدست آمده برای تعیین غلظت فلاونوئید کل استفاده گردید (شکل ۳-۳).

شکل ۳-۳- نمودار استاندارد کوئرستین
۳-۸- اندازه‌‌گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با بهره گرفتن از دستگاه HPLC
۳-۸-۱- آماده ­سازی نمونه
به منظور تعیین نوع ترکیبات فنلی موجود در عصاره از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. برای این منظور جهت آماده‌‌سازی نمونه، یک گرم نمونه (برگ، ریشه، ساقه و گل) پودر شده با دقت ۰۰۱/۰ توزین گردید و در ۱۰ میلی‌لیتر متانول خالص (۱: ۱۰) مخصوص HPLC همگن شد، و به مدت ۱۰ دقیقه در اولتراسوند قرار داده شد (لوله محتوی محلول کاملاً به وسیله فویل آلومینیومی در برابر نور محافظت گردید) و به مدت ۱۲ ساعت روی همزن قرار داده شد، سپس به مدت ۱۰ دقیقه در دور ۳۵۰۰ سانتریفیوژ گردید. بخش فوقانی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرنگی، به ظروف مخصوص HPLC منتقل گردید و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد. مشخصات دستگاه به شرح زیر بود:
مدل دستگاه: مرک- هیتاچی ال- ۷۱۰۰
دتکتور: دیود اری هیتاچی ال- ۲۴۵۰^[۹]
آون ستون: هیتاچی ال-۲۳۰۰^[۱۰]
نوع ستون: آر پی- ۱۸^[۱۱] با ابعاد ۶/۴ × ۲۵۰ میلی‌متر و اندازه ذرات ۵ میکرومتر
فاز متحرک مورد استفاده در این بررسی شامل ۱ میلی­لیتر اسید­استیک، ۸۹ میلی­لیتر آب مقطر دیونیزه شده و ۱۰ میلی­لیتر استونیتریل با سرعت جریان یک میلی­لیتر در دقیقه و دمای ۲۵ درجه سانتی‌‌گراد بود. با مقایسه زمان تأخیر و سطح زیر منحنی نمونه با نمونه‌‌های استاندارد، میزان اسید کافئیک و اسید کلروژنیک تعیین و در نهایت بر اساس میلی‌‌گرم بر گرم وزن خشک برگ یا دیگر اندام خشک بیان گردید. (تراجیتنبرگ و همکاران، ۲۰۰۸؛ سانتوز-گامز و همکاران، ۲۰۰۳).
۳-۸-۲- تهیه نمودار کالیبراسیون اسید کلروژنیک و اسید کافئیک