۱۱۷۳-P2 (1961) By: Augier
۱۱۷۳-P2 LotC 84 (1984) By: Gheorghiu
۲-۲۱-۴. ایمنی­زایی
بیش از ۷۵ سال از مصرف واکسن BCG می­گذرد و تا کنون میلیون­ها دز از آن به نوزادان و کودکان در سراسر دنیا تزریق شده است، ولی مکانیزم مصونیت آن در برابر بیماری سل و تاثیر آن بر سیستم ایمنی ناشناخته است.
با درک مکانیزم ایمنی­زایی BCG نه تنها طراحی واکسن­های جدید تسهیل می­ شود بلکه بر اساس آن می­توان تست­های سریع جهت مصونیت حاصل از انواع واکسن­ها را نیز پایه­گذاری کرد. یکی از علل کار­آیی (efficacy) بسیار متغییر واکسن BCG در پیشگیری از بیماری سل می ­تواند تفاوت پاسخ­های ایمنی القا شده توسط BCG با پاسخ­های مورد نیاز جهت دفاع موثر علیه سل باشد .(Colditz G.A. et al., 1994) لذا درک مکانیسم ایمنی­زایی واکسن BCGو مقایسه آن با جنبه ایمونولوژیک بیماری سل بسیار حایز اهمیت است.
یک ویژگی مشترک BCG M. bovis و M. tuberculosis زیستگاه داخل سلولی آنها است، به گونه ­ای که زیستگاه هر دو باکتری در بدن میزبان سلول­های ماکروفاژ بوده و هر دو باکتری می­توانند داخل این سلول­ها زنده مانده و تکثیر نمایند و در نهایت عفونت ایجاد کنند. طی عفونت ناشی از BCG M. bovis اغلب باکتری­ ها توسط ماکروفاژهای فعال شده از بین رفته و تنها تعداد اندکی از باکتری­ ها داخل فاگوزوم ماکروفاژها باقی مانده و باعث عفونت مزمن بدون علایم بالینی می­شوند. لنفوسیت­های T مسئول فعالسازی ماکروفاژها از نوع CD4 بوده و نقش کلیدی آنها در پاسخ به عفونت BCG به اثبات رسیده است. عفونت با این باکتری موجب القا ترشح IFN توسط T CD4 اختصاصی آنتی­ژن می­ شود. IFN در زمینه عملکردهای ضد مایکوباکتریایی ماکروفاژهای فعال شده دخالت دارد و توسط سلول­های T CD4 نیز به میزان کمتر تولید می­ شود. عملکرد دیگر سلول­های T CD4 فعالیت سیتولیتیک آنها است. بر اساس مطالعات انجام شده بر روی موش­های دارای نقایص ژنتیکی در عملکرد سلول­های T CD4 وT CD8 مشخص شده­است که سلول­های T CD4 جهت کنترل عفونت ناشی از M. bovis BCG طی ماه­های اول عفونت ضروری و کافی است. به هر حال سلول­های T CD8با تعداد زیاد هم می­توانند در ایجاد مقاومت نسبت به این عفونت دخالت داشته باشند (Rook G.A and Stanford J.L., 1996).
بنابراین کنترل عفونت BCG M. bovis تا حد زیادی وابسته به سلول­های T CD4 بوده که با تولید سایتوکاین­های خاص عملکردهای ضد مایکوباکتریایی ماکروفاژها را موجب می­ شود.

بر خلاف BCG در مورد M. tuberculosis باید گفت که فعال شدن ماکروفاژها به تنهایی برای دفاع علیه این باکتری کافی نیست. به مانند عفونت BCG M. bovis فعالیت ماکروفاژهای ناشی از عملکرد سلول­های T CD4 و به میزان کمتری در اثر سلولهای T CD8 است ولی M. tuberculosis توانایی غیر فعال کردن ماکروفاژها با مکانیزم­ های مختلفی را دارا است. این باکتری با تولید آمونیاک و سولفاتیدها موجب مهار ادغام فاگوزوم و لیزوزوم می­ شود. از طرفی باسیل سل با سوء استفاده از گیرنده­های کمپلمان (CR1 , CR3) برای جذب و نیز به اتصال با گیرنده­های فیبرونکتین و ویکرونکتین پدیده انفجار اکسیداتیو را مختل می­ کند. ترکیبات دیواره سلولی مایکوباکتری­ها اثرا سایتوکاینی را تغییر داده و نیز در تولید واسطه­های فعال اکسیژن (ROI) اختلال ایجاد می­نماید. سایر عملکردهای افکتوری ماکروفاژها نیز تحت تاثیر این باکتری قرار می­گیرد.
بنابراین جهت مصونیت مطلوب در برابر عفونت­های M. tuberculosis نابودی ماکروفاژهای آلوده الزامی است تا باکتری­ ها توسط ماکروفاژهای کارا بلعیده شوند. سلول­هایی که ماکروفاژهای غیر غعال را نابود می­ کنند احتمالا لنفوسیت­های T سایتولتیک هستند. پاسخ سایتولیتیک عمدتا توسط سلول­های T CD8 ابراز می­ شود و مواردی از این پاسخ­ها بصورت اختصاصی علیه مایکوباکتری­ها نیز گزارش شده است.
بر اساس مطالعات انجام شده سلول­های T CD8 در ایجاد مصونیت نسبت به M. tuberculosis بایستی ایفای نقش کنند. در نتیجه ایجاد مصونیت مبتنی بر سلول­های T بوده که در آن تولید IFN توسط سلول­های T CD4 با عملکرد سایتولیتیک­های سلول­های T CD8 همراه می­ شود.
۲-۲۱-۵. لزوم طراحی واکسن جدید
واکسنی که در حال حاضر برای مقابله با بیماری سل به کار می­رود، واکسنی است که از سویه زنده ضعف شده مایکوباکتروم بوویس تهیه می­ شود. این واکسن به خوبی قادر است با مننژیت سلی نوزادان و با توجه به محیط در مواردی با سل ریوی مقابله کند .(Rook GAW.et al., 2001) ولی آیا این واکسن به اندازه­ای ایمنی در برابر بیماری سل می­دهد که ما را بی­نیاز از یافتن واکسن جدید کند؟ واقعیت این امر است که با توجه به گزارش­های مختلف در سطح جهان می ­تواند این طور استنباط کرد که کارآیی این واکسن در برابر سل ریوی و یا عود مجدد بیماری از ۸۰ تا صفر درصد متغییر است .(Fine PEM., 1993)
پاره­ای از معایب واکسن ب ث ژ به قرار ذیل هستند :
عدم حفاظت کامل در برابر سل تنفسی بزرگسالان (فقط ۵۰% از افراد واکسینه شده در برابر فعال شدن مجدد سل مقاومت نشان می­ دهند)
استفاده از این واکسن، به دلیل قرابت آنتی­ژنیک با باسیل مولد بیماری در تست بیماری توبرکولین که برای ردیابی بیماری سل استفاده می­ شود، ایجاد اشکال می­ کند.
درصورتیکه فرد با مایکوباکتریوم­های محیطی برخورد کرده باشد، به دلیل فعال شدن سیستم ایمنی بر علیه آن­ها و قرابت آنتی­ژنیک این باسیل­ها با مایکوباکتریوم بوویس ب ث ژ، سیستم ایمنی بر علیه آنها فعال شده و در صورت تزریق واکسن، باسیل مورد استفاده در واکسن به واسطه مقابله سیستم ایمنی از بدن حذف شده و ایمنی ایجاد نمی­ شود .(Stanford J.L. et al., 1981)
باسیل استفاده شده در این واکسن زنده بوده و در صورت استفاده در فرد دچار ضعف سیستم ایمنی می ­تواند خطرساز باشد.
در مناطق استوایی به دلیل آلودگی افراد با کرم­ها و انگل­ها، پاسخ قوی Th2 در پاسخ به عفونت ایجاد می­ شود که از پاسخ میزبان به واکسن ممانعت نمود و ایمنی ایجاد نمی­ شود (Rook G.A.W.et al., 2001).
استفاده از دوز بالای ب.ث.ژ باعث ایجاد پاسخ­های Th2 می­ شود.
روش استفاده از واکسن به دلیل تزریقی بودن، تهاجمی می­باشد.
۲-۲۲. پروتئومیکس مایکوباکتریوم­ها
نیاز روز افزون در شناخت ماهیت، چگونگی و روش عملکرد محصول ژن­ها، یعنی پروتئین­ها، منجر به ظهور پروتئومیکس (Proteomics) گشته­ است. پروتئومیکس به بررسی محتوای پروتئینی و یا پروتئوم (Proteome)، یک سلول یا بافت و یا مایع فیزیولوژیک در شرایط تکاملی، محیطی و یا آسیب شناسی مشخص می ­پردازد .(Beranova-Giorgianni S., 2003) از دیدگاه بیوشیمیست­ها پروتئومیکس، مطالعه بیش از یک پروتئین در یک زمان خاص است. کلمه پروتئوم نخستین بار در سال ۱۹۹۴ برای توصیف مجموعه‌ای ازپروتئین‌ها که توسط یک ژنوم کد­گذاری شده‌­است، ابداع شد.
پروتئومیکس کاربردهای زیادی دارد، عمده‌ترین کاربردها در این زمینه عبارت است از:
-تشخیص بیماری‌های عفونی و بیماری‌های مشترک انسان و دام
-تشخیص زودرس بیماری‌های بدخیم
الکتروفورز دو بعدی (Two Dimensional Electrophoresis, 2DE) یکی از رایج­ترین و قدرتمندترین روش­های جداسازی پروتئین­ها بخصوص در پروتئومیکس است. این روش در حدود سی سال پیش با بهره­ گیری از تفاوت موجود در دو خصوصیت ذاتی پروتئین­ها، یعنی بار الکتریکی و وزن مولکولی، ابداع شده است .( Reddy K and Perrotta P., 2004) روش­های نوین و جایگزین دیگری برای جداسازی پروتئین­ها ابداع شده ­اند، مانند استفاده از فناوری­های ریزسیال­ها (Microflouidics) و چیپس (Chips)، استفاده از فناوری چند بعدی در تعیین هویت پروتئین (Multidimensional protein identification technology, MudPIT) که بر پایه کروماتوگرافی مایع دوبعدی قرار دارد، آنالیز مسقیم مخلوط­های پروتئینی با طیف ­سنجی جرمی(Mass spectrometry, MS)، استفاده از برچسب­های با میل ترکیبی اختصاصی (Affinity tags)، و غربالگری توسط روش ” مخمر-دو هیبرید” (Yeast-two hybrid) در مقیاس بالا (Graves P.R. and Haystead T.A.J).
امروزه تفکیک پروتئین­های بافت­ها توسط روش­های الکتروفورز دوبعدی، SDS-page و شناسایی آنها توسط طیف­سنج جرمی میسر است .( Wittmann_Liebold B. et al., 2006) استفاده از روش SDS-page در تخمین وزن مولکولی پروتئین­ها اولین بار توسط Shapivo و همکارانش در سال ۱۹۶۷ گزارش گردید و بعدها در ۱۹۶۹ محققینی با نام­های weber و Osborn این تجزیه را تایید کردند و سرانجام توسط laemmli در ۱۹۷۰ به شکل امروزی جهت تعیین وزن مولکولی پروتئین­ها در آزمایشگاه­های تحقیقاتی تبدیل گردید.
پروتئین­های طبیعی دارای بار الکتریکی، وزن مولکولی و شکل فضایی متفاوتی هستند و این عوامل در حرکت الکتروفوریتکی پروتئین­ها موثراند. Weber و Osborn نشان دادند که الکتروفورز ژل پلی­آکریل­آمید در حضور دترخبت یونی سدیم­دودسیل­سولفات یا لوریل­سولفات یکی از کارآمدترین روش­ها برای تعیین وزن مولکولی پروتئین­های نمونه می­باشد .( Wittmann_Liebold B. et al., 2006)
این روش ضمن ساده بودن به میزان اندک نمونه جهت آزمایش نیاز دارد و دارای قدرت تفکیک مناسب جهت شناسایی و تعیین خلوص پروتئین­هاست.
بطور کل پروتئین­ها متنوع­ترین ماکرومولکول­ها در سیستم­های زنده هستند. بنابراین عملکردهای بسیار مهمی در تمام فرایندهای زیستی بر عهده دارند، پاره­ای از عملکردهای پروتئین­ها به قرار زیر است:
پروتئین­ها به عنوان کاتالیزور عمل می­ کنند و فرایندهای متابولیکی را در سلول انجام می­ دهند.
پروتئین­ها عمل ساختاری در داخل و خارج از سلول دارند.
پروتئین­ها در یک سلول ممکن است به عنوان پیام ­(signal)­ ترشح شده و در بخش­های خارج سلولی(extracellular) ذخیره شوند، سپس توسط سلول­های دیگر شناسایی شوند.
آن­ها به عنوان گیرنده (receptor) باعث انتقال اطلاعاتی از قسمت های خارج سلول به داخل سلول می­شوند.
آن­ها ممکن است به صورت ترکیبات پیام­رسان داخل سلولی (intracellular) عمل کنند و روی گیرنده­ها اثر بگذارند.
پروتئین­ها ترکیبات اصلی ماشین بیان ژن هستند و تعیین­کننده بیان ژن­های بخصوصی می­باشند. آن­ها در ترجمه mRNA ها به پروتئین­ها دخالت دارند.
آن­ها در انجام عمل همانندسازیDNA، برش RNA(splicing) و پیرایش (editing) دخالت دارند.
پروتئومM. tuberculosis در سال ۲۰۰۴ به طور کامل مشخص شد. جداسازی پروتئین­های مختلف چندین سویه از باکتری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به وسیله الکتروفورز پس از قرارگیری پروتئین­های حاصله بر روی باندها و شناسایی پروتئین­های حاصله نشان داده است که این پروتئین­ها به چند گروه تقسیم می­شوند.
گروه اول، پروتئین‌های متابولیسمی می­باشند که در فرایندهایی شامل متابولیسم کربوهیدرات‌ها، لیپیدها، زنجیره تنفسی و فسفریلاسیون اکسیداتیو نقش دارند. این گروه از پروتئین­ها در دیواره سلولی باکتری قرار دارند و شامل زنجیره بتا سنتز آدنوزین مونوفسفات‌اند. در این گروه ناقل‌های الکترون بیشترین میزان پروتئین‌ها را بر روی ژل نشان می دهند.
گروه دوم، شامل پروتئین‌های تنظیمی‌اند که ساختار شیمیایی تعریف شده‌ای دارند. به عنوان مثال متوقف کننده رونویسی(NUSG ) و تنظیم کننده‌های متانول (MOXR).
گروه سوم، شامل آنتی ژن‌های ­HSPXاند که برای دوام و بقاء باسیل ضروری­اند.
پروتئین­های ترشحی^[۶۶] و سطحی نقش به سزایی در برانگیختن ایمنی سلولی موثر و تشخیص TB را دارند. فیلترهای کشت M. tuberculosis حاوی آنتی­ژن­های مختلفی می­باشد .بسیاری از آن­ها با بهره گرفتن از آنتی­بادی­های منوکلونال شناسایی شده و مورد بررسی قرار گرفت­­اند. بسیاری از این آنتی­ژن­­ها، پروتئین­های ترشحی موجود دردیواره باکتری و یا پروتئین­های رها شده از جسم باکتری­ های مرده هستند که قادر به ایجاد پاسخ ایمنی در مراحل ابتدایی ایجاد عفونت در بیمار می­باشد (Sonnenberg M.G. and Belisle J.T., 1997). پروتئین­­های ترشحیM. tuberculosis تا به امروز به شکل گسترد­ه­ای مورد بررسی قرار گرفته­اند و مشخص شده است که این آنتی­ژن­ها قادر به القای پاسخ ایمنی در حیوانات آزمایشگاهی می­باشند .(Uma Devi K.R. et al., 2002)
از جمله این پروتئین­های می­توان به موارد زیر اشاره کرد:
پروتئین regx3 که در واقع جزء سیستم تنظیم­کننده دو جزئی می­باشد باشد و در ویرولانس نقش دارد و ۵۰ ژن تحت تاثیر این پروتئین قرار دارند.
پروتئین­های دخالت کننده در واکنش­های اکسید و ردوکتاز که از پروتئین غشایی می­باشد. نشان داده شده است که بیان این پروتئین­ها در دو سویهM. tuberculosis و ب.ث.ژ متفاوت است و این پروتئین­ها قبلا به عنوان کاندید واکسنی مطرح شده بودند.
پروتئین wag3 که در واقع یک آنتی­ژن و همولوگ پروتئین سلولی است و در واقع سوبسترای آنزیم PKnA و PKnB می باشد که در تقسیم سلولی نقش دارد.
پروتئین OPCA که شبیه آنزیم گلوکزدهیدروژناز می­باشد.
پروتئین FixB که در واقع زیر واحد آلفای فلاوپروتئین می­باشد در نقل و انتقال الکترون نقش دارد.
پروتئین­های بسیار متغیر PE-PGRSو PPE-MPTR که یکی از بزرگترین منابع تغییرات آنتی ژنیکی در این باکتری­اند که دو خانواده ژنی مهم (PPE, PE) درM. tuberculosis مسئول کد گذاری این پروتئینها می­باشند. ولی قسمت-C-ترمینال به صورت متغیر می­باشد و انتهای آن از ۱۴۰۰-۱۰۰ اسید آمینه تشکیل شده است. این نام­ها ازموتایف­های ­Pro-Glu(PE) (به تعداد ۹۹ اسید آمینه) و Pro-Pro-Glu(PPE) (به تعداد ۶۸ اسید امینه) در انتهای N ترمینال پروتئین­های PPE,PE ناشی می­ شود که به صورت حفاظت شده و شکل حاصل از آن کروی می­باشد. عمل این پروتئین­ها مشخص نشده است، ولی پروتئین­های آنها حاوی توالی­های تکراری از اسیدهای آمینه خاص در C ترمینال می­باشند. محصولاتی مثل Mtb41 , Mtb39a که وابسته به این پروتئین­ها­اند، اهدافی برای سیستم ایمنی اند که می­توانند به عنوان کاندیدی برای واکسن باشند (Delogu, G. and Brennan M.J., 2001).
کمپلکس آنتی­ژنی ۸۵ که این کمپلکس پروتئینی از سه پروتئین مجزا با همولوژی بالا به نام­های ۸۵C ,85B ,85A و یا FbpC2 ,FbpB ,FbpA تشکیل شده است که هر کدام دارای وزن مولکولی نزدیک به ۳۰ کیلو دالتون می­باشند. فعالیت مایکولیل ترانسفرازی در ساخت دیواره باکتری و در بیوسنتز فاکتور طنابی شدن دارد (Dheenadhayalan V. et al., 2002). این پروتئین­ها به وسیله ۳ ژن جداگانه کد شده و از لحاظ توالی (۹۸-۶۸ درصد) شباهت دارند. این آنزیم جزو فراوان ترین پروتئین­های ترشحی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس است که در مرحله اولیه بیماری ترشح می­ شود و به فراوانی در ماکروفاژهای آلوده به این باکتری یافت می­ شود. به تازگی مشخص شده است که پروتئینc از این کمپلکس در اتصال کووالانسی اسید مایکولیک به آرابینوگالاکتان (Arabinogalactan) ، نقش مهمی دارد. آنتی­ژن­های غالب در پاسخ های سلول­های CD8+T و CD4+T می­باشند.
آنتی­ژن MPB51 که یکی از پروتئین­های اصلی ترشحی می­باشد که با سه جزء کمپلکس آنتی­ژنی ۸۵ واکنش متقاطع داشته و از نظر ساختمانی نیز ۴۳ درصد با جزء مایکولیل ترانسفراز آنها تشابه دارد.
آنتی­ژن MPT64 که دارای وزن مولکولی ۲۴ کیلو دالتون می­باشد .(Marzouk M. et al., 2011)
خانواده آنتی­ژنی ESAT-6 که دارای وزن مولکولی ۶ کیلو دالتون بوده که شامل یک دسته عمومی پروتئین در خانواده اکتینوباسیلوس­ها می­باشند که عمل طبیعی آنها هنوز مشخص نشده است ولی گمانه زنی­هایی مبنی بر ویرولانس فاکتور بودن وجود دارد. علارقم عدم وجود توالی رهبر برای ترشح پروتئین ESAT6، این پروتئین یکی از اجزاء غالب و قوی فیلترهای کشت مایکوباکتریومی است که بسیار آنتی­ژنیک می­باشد. CFP-10 کمپلکس این خانواده آنتی­ژنی است با وزن مولکولی آن ۱۰ کیلو دالتون است .(Farshadzadeh Z. et al., 2010)
آنتی­ژن­های ترشحی توسط باکتری M. tuberculosis سالیان متمادی است که به عنوان هدف در طراحی داروهای ضد مایکوباکتریومی بخصوص کاندیدای واکسن مورد توجه­ قرار گرفته­اند. به تازگی با متدهای بیوانفورماتیک ۵۲ پروتئین به عنوان آنتی­ژن ترشحی شناخته شده ­اند.